冻干去抗原羊松质骨支架的生物相容性评价

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.16.007

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (16): 2499-2505.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.16.007

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冻干去抗原羊松质骨支架的生物相容性评价

周政¹，杨泽辉²，何惠宇²，崔杰²

¹石河子大学第一附属医院口腔科，新疆维吾尔自治区石河子市 832000；²新疆医科大学第一附属医院口腔修复科，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830054

修回日期:2014-03-01 出版日期:2014-04-16 发布日期:2014-04-16
通讯作者: 何惠宇，硕士生导师，教授，新疆医科大学第一附属医院口腔修复科，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830054
作者简介:周政，男，1977年生，江苏省南京市人，汉族，新疆医科大学第一附属医院在读硕士，主治医师，主要从事骨组织工程及种植的研究。
基金资助:
国家自然科学基金项目(81060088)，课题名称：三维打印构建组织工程化牙槽骨的实验研究。

Biocompatibility of freeze-dried antigen-extracted sheep cancellous bone scaffolds

Zhou Zheng¹, Yang Ze-hui², He Hui-yu², Cui Jie²

¹Department of Stomatology, First Affiliated Hospital of Shihezi University, Shihezi 832000, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China; ²Department of Prosthodontics, First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China

Revised:2014-03-01 Online:2014-04-16 Published:2014-04-16
Contact: He Hui-yu, Master’s supervisor, Professor, Department of Prosthodontics, First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China
About author:Zhou Zheng, Studying for master’s degree, Attending physician, Department of Stomatology, First Affiliated Hospital of Shihezi University, Shihezi 832000, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81060088

摘要/Abstract

摘要：

背景：异种骨具有与人类骨类似的天然多孔结构，在治疗骨缺损时可引导骨组织再生，但植入过程中也会引起不同程度的免疫反应。

目的：采用冻干法制备去抗原羊脊椎松质骨支架材料，并评价其生物相容性。

方法：取羊脊椎松质骨，制备两组去抗原异种骨支架，化学组经H₂O₂、甲醇/氯仿混合液等化学试剂处理；冻干组将经化学处理的羊松质骨在-80 ℃冰箱中低温冷冻4周，真空干燥，⁶⁰Co照射消毒。①细胞毒性实验：分别采用化学组材料浸提液、冻干组材料浸提液与DMEM/F12培养基培养羊骨髓间充质干细胞。②热源实验、急性毒性实验：从兔耳缘静脉分别注射化学组材料浸提液、冻干组材料浸提液与生理盐水。③皮内刺激实验：分别在兔脊柱背部皮下注射化学组材料浸提液、冻干组材料浸提液、生理盐水及乙醇。

结果与结论：冻干组支架无细胞毒性、急性毒性及热源反应，皮内刺激实验阴性；化学组支架有细胞毒性及轻微急性毒性反应，有致热源作用及轻度皮肤刺激性。结果表明经过化学处理羊脊椎松质骨支架的生物相容性相对较差，而化学处理配合低温冷冻、真空干燥及⁶⁰Co照射的羊脊椎松质骨生物相容性较好，基本能达到骨组织工程支架材料的要求。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

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关键词: 生物材料, 骨生物材料, 支架材料, 冻干骨, 免疫反应, 细胞毒性, 生物相容性, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Xenogeneic bone has a natural porous structure that is similar to human bone. In the treatment of bone defects, the porous structure is helpful to guide bone regeneration, but different degrees of immune responses will be caused during the implantation process.

OBJECTIVE: To prepare a freeze-dried antigen-extracted sheep cancellous bone scaffold and to evaluate its biocompatibility.

METHODS: The sheep vertebral cancellous bone was collected to prepare two kinds of antigen-extracted heterologous bone scaffolds that were treated with chemical methods as chemical group and treated with chemical methods+cryopreservation at a -80 ℃ refrigerator for 4 weeks+drying in vacuum apparatus+⁶⁰Co irradiation as freeze-dried bone group. (1)Cytotoxicity test: Bone marrow mesenchymal stem cells isolated from sheep were cultured in extracts of the chemical group, free-dried bone group and Dulbecco’s modified Eagle’s medium/Ham’s nutrient mixture F-12. (2) Heat reaction and acute toxicity tests: Extracts from the chemical group, freeze-dried bone group and normal saline were respectively injected into the ear vein of rabbits. (3) Intracutaneous stimulation test: Extracts from the chemical group, freeze-dried bone group and normal saline were respectively injected subcutaneously into the back of rabbits.

RESULTS AND CONCLUSION: Freeze-dried bone had no cytotoxicity, no acute toxicity and heat reaction, and was negative for the intracutaneous stimulation test. The scaffold in the chemical group had cytotoxicity and mild acute toxicity reaction, sent heat source and had mild irritation. Results show that after freeze drying processing, the sheep vertebral cancellous bone has good biocompatibility, can meet the requirements of bone tissue engineering, but the bone that through chemical processing exhibits a relatively poor biocompatibility that cannot achieve the safety standard of biological scaffold materials.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

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Key words: biocompatible materials, freeze drying, braces, tissue engineering

中图分类号:

R318

周政，杨泽辉，何惠宇，崔杰. 冻干去抗原羊松质骨支架的生物相容性评价[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(16): 2499-2505.

Zhou Zheng, Yang Ze-hui, He Hui-yu, Cui Jie. Biocompatibility of freeze-dried antigen-extracted sheep cancellous bone scaffolds[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(16): 2499-2505.

图/表（结果） 4

2.1 羊骨髓间充质干细胞的培养及传代 原代细胞刚接种时呈球形，在培养液中呈悬浮状态，第2天已经开始贴壁，细胞的形态逐渐由球形向椭圆形变化，4 d后细胞的形态呈多样性变化，不仅大小不同，而且形状各异，有多角形、梭形等不规则的形状。之后几天细胞数量开始剧增，并且大部分聚集于瓶底，细胞有多样性逐渐长为长的梭形，大概9 d后完全覆盖于培养瓶底部，见图1A，B。

传代细胞接种后可在24 h内贴附于培养瓶壁，同原代细胞一样呈长的梭形，但是体积有所增长，传代细胞大概在第6天时将培养瓶底完全覆盖，第3代传代细胞在形态上变化不大，但是增长速度很快，细胞活力很强，见图1C，D。

2.2 细胞毒性实验 细胞毒性实验经过12 d的检测后，经过各组间A值的统计分析，冻干组与对照组之间比较差异无显著性意义(P > 0.05)，冻干组、对照组与化学组之间比较差异有显著性意义(P < 0.05)。冻干组培养液吸光度值在前9 d随时间变化呈递增趋势，之后逐渐下降，与对照组趋势相同；化学组吸光度值在前7 d呈增长趋势，之后逐渐下降，且同一时间点吸光度值低于冻干组及对照组，提示化学组材料浸提液抑制细胞增殖分化，存在较大细胞毒性(图2)。

冻干组材料对羊骨髓间充质干细胞毒性很小，为0或1级，细胞相对增殖率均>90%，说明冷冻干燥羊松质骨支架材料没有细胞毒性；化学组开始没有毒性，但2 d以后细胞相对增殖率在58.04%-73.50%，材料毒性达到2级，说明其存在细胞毒性。
2.3 急性毒性实验 经过观察，冻干组材料浸提液注射过的兔在7 d内精神很好，饮食活动跟平常无差异，呼吸正常无运动减少等毒性反应；化学组材料浸提液注射过的兔短期内有轻度呼吸困难症状，3 h后症状消失；对照组在注射同剂量生理盐水后7 d内精神良好，饮食活动跟平常无差异。3 d内各组动物体质量均增加，通过方差分析检验3组动物体质量每天的平均增加差异无显著性意义(P > 0.05)，见表1。按照材料毒性的分级^[12]，冻干组材料无毒性，化学组浸提液有轻度毒性。

7 d后处死实验动物，随机抽取1只兔取肝、脾、肾作苏木精-伊红染色，经过观察各组肝、脾、肾苏木精-伊红染色片无异常(图3)。

2.4 热源实验结果 3组实验动物注射完各自材料浸提液及生理盐水后，冻干组和对照组动物在1，2，3 h三个时间段测得升高温度都<0.6 ℃，升高总数最高为0.85 ℃和0.7 ℃，亦达到国家标准(<1.4 ℃)；化学组实验动物3个时间点测得的温度均>0.6 ℃，而且升高温度总和最高为2.45 ℃，未达到国家标准(<1.4 ℃)；经过统计及方差分析，冻干组、对照组与化学组之间体温变化差异有显著性意义(P < 0.05)，见表2。

2.5 皮内刺激实验 冻干组在1，6，24，48，72 h观察背部皮肤没有明显的红斑、水肿及坏死，按照皮肤反应的评分系统得出APⅡ为0.37，为极轻微刺激；化学组在24 h及48 h时出现轻微红斑，按评分系统APⅡ为0.64，为轻度刺激；阴性对照APⅡ为0；阳性对照APⅡ为5.15，为重度刺激(表3)。

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引言

颌面部骨组织的缺损有多种原因，较大缺损由车祸致面部组织损伤、肿瘤等占位性病变及大面积切除引起，而由牙齿缺损、牙周病等原因引起的牙槽骨吸收也可造成颌面部骨组织缺损近骨的无机成分，具备生物相容、亲水性好、力学强度佳。在口腔修复过程中大部分运用自体骨，但自体骨局限性太大，不仅量少且易造成感染，感染率可达30%^[1]，大多数患者不能承受对自身的再次损害，致使自体骨发展受到很大限制。异种骨支架材料以其广泛来源，无二次损害，容易存放，以及经过处理后亦能达到组织工程支架材料的多孔隙三维结构体，与人类骨组织结构类似，使异种骨支架材料的研究及处理成为研究的一个热点^[2-3]，有力缓解了自体骨来源不足的问题^[4]。而异种骨支架材料应用于人体中要求必须无毒性。良好的支架材料应同时具备以下特点：生物相容性好，没有任何毒性，不会引起炎症，更不会引起畸形；有良好的力学性能，机械性能良好，在承受一般力量时不会造成塌陷及变形；降解性能良好，降解应与新骨生成速率相匹配；有良好的空间结构，便于血管细胞攀附、营养运输及代谢物排出。

异种骨支架材料的主要处理方法有脱脂、脱蛋白、高温煅烧、低温冷冻等，现在已有一些产品如Bio-oss、kiel骨粉等，在临床应用过程中它们不存在免疫原性，但后期诱导成骨能力不好，并且力学性能欠佳，有研究在用脱蛋白法处理猪肋骨过程中亦得到了相近的结论。通过低温冷冻处理支架材料保留了具有骨诱导作用的骨形成蛋白，对骨组织有较好的骨诱导能力。

由于新疆少数民族众多，且大部分有伊斯兰教的信仰，为了尊重他们这一信仰，也为了实验成果能更好地服务于各族人民，实验选用羊松质骨作为支架材料来源，且羊来源广泛，成本与其他动物相似，也利于实验实施。在异种骨移植过程中容易引起免疫反应，所以对支架材料的免疫原性能有很高的要求，尤其是口腔颌面部骨缺损，如果出现免疫排斥会影响美观，给患者心理及生理造成很大的损伤，所以在生物相容性检测过程中，采用支架材料浸提液进行细胞毒性实验、动物急性毒性实验、热源实验等检测冻干骨支架材料的免疫原性；严格按照实验设计选择动物，进行细致的数据统计及分析，尽量减小误差，使结果准确，初步评价冻干骨支架材料的性能，为后面构建三维骨组织工程支架材料提供实验依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程
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材料方法

设计：动物体内观察实验，体外观察实验。

时间及地点：细胞毒性实验于2013年7至8月在新疆医科大学第一附属医院科技楼新疆医学动物模型实验室完成，动物实验于2013年9至11月在新疆医科大学第一附属医院动物中心完成。

材料：

实验标本及动物：成年绵羊椎体松质骨取自1岁龄雄性阿勒泰大尾羊；3月龄健康雄性阿勒泰大尾羊1只，体质量20 kg，动物编号：RACUC-20130709007，动物由新疆医科大学第一附属医院动物实验中心提供。

SPF级新西兰大白兔，体质量2.5-3.5 kg，雌雄不拘，由新疆医科大学第一附属医院动物实验中心提供，动物编号：RACUC-20130709007。实验符合动物伦理学要求，且严格遵守《关于善待实验动物的指导性意见》的要求^[5]。

实验方法：

羊椎骨异种骨材料的制备：①化学组：将新鲜松质骨表面的骨膜、密致骨等去除干净，用去离子水反复冲洗，待冲洗液颜色变化不大时为止，在体积分数30%H₂O₂中浸泡12 h，然后在甲醇/氯仿混合液(1∶1)中浸泡12 h，重复3遍，每一遍后需超声清洗1次，最后去离子水冲洗干净后，高温高压消毒备用。②冻干组：将新鲜松质骨表面的骨膜、密致骨等去除干净，用去离子水反复冲洗，待冲洗液颜色变化不大时为止，在体积分数30%H₂O₂中浸泡12 h，然后在甲醇/氯仿混合液(1∶1)中浸泡12 h，重复3遍，每一遍后需超声清洗1次，最后去离子水冲洗干净后，放入-80 ℃冰箱中低温冷冻4周，然后放入真空仪器中干燥，⁶⁰Co照射后保存备用。

材料浸提液的制备：将制取的化学组与冻干组异种骨支架材料消毒后分别放入生理盐水中，材料质量浓度为0.1 g/mL，然后放入37 ℃的恒温水浴箱中，连续浸泡72 h后，在超净工作台中用0.22 µm的滤器去除浸提液中的细菌杂质，放入经过消毒的50 mL离心管中，密封后放入4 ℃冰箱中保存。

细胞毒性实验：

羊骨髓间充质干细胞的分离与培养^[6]：取3月龄健康阿勒泰大尾羊1只，在麻醉状态下，用18号骨穿针在髂骨穿刺骨髓腔，可感觉到明显落空感，此时用内含肝素的注射器抽取10 mL骨髓，经过100目滤网去除骨髓中的细菌，将5 mL骨髓与5 mL D-Hank’s按1∶1比例混合，此时与 10 mL的淋巴细胞分离液于离心管中均匀混合， 2 000 r/min离心20 min，将位于中间乳白色的有核细胞层吸出，并加入D-Hank’s液5 mL，1 500 r/min 10 min，吸取上清液，将2 mL DMEM/F12加入到剩余的沉淀中，经过吹打制成单细胞悬液，接种于25 cm²培养瓶中，放入37 ℃、体积分数5%CO₂饱和湿度孵箱内，4 d后第1次换液，将悬浮的细胞吸取丢弃，以后每3 d换1次液。当融合成单层细胞后，用2.5 g/L胰蛋白酶传代培养，直到第3代融合成单层细胞后收集备用。以细胞形态、流式细胞仪、成骨及成脂分化实验鉴定为干细胞。

MTT法检测材料的细胞毒性：取第3代羊骨髓间充质干细胞，根据活力调整细胞浓度为4×10³/孔，取12个96孔板，实验分3组，实验组分别将细胞悬孔培养液换成两组对应材料浸提液(200 µL/孔)，对照组为DMEM/F12培养液，每3 d换液1次，每天测一组96孔板，共12 d，测试前每孔加入50 g/L MTT液20 µL，4 h后换为二甲基亚砜，将酶标仪波长设定490 nm，测吸光度A，并求细胞相对增殖率：细胞相对增殖率=实验组A值/对照组A值×100%，根据细胞相对增殖率值判断支架材料的毒性。毒性程度评定标准^[7-9]：0级，细胞相对增殖率≥100%；1级，细胞相对增值75%-99%；2级，细胞相对增殖率50%-74%；3级，细胞相对增殖率25%-49%；4级，细胞相对增殖率1%-24%；5级，细胞相对增殖率为0。

急性毒性实验：将18只新西兰白兔随机均分为3组，其中两组为实验组，将兔固定后通过耳源静脉分别注射两组材料浸提液10 mL/kg，另一组为注射生理盐水的对照组，观察动物生存状态，于24，48，72 h测其体质量，观察与初始体质量相比的变化。7 d后处死，从每组随机抽取1只兔取肝、脾、肾作苏木精-伊红染色。通过肝、脾、肾的组织学观察，并与正常组织相比较，判断材料对动物是否有损害。

热源实验：实验前7 d取9只新西兰白兔，随机均分3组，预测肛温，在安静环境下将兽用体温计插入兔肛门 5 cm左右，5 min后取出读数，1 h 1次，测3次，体温范围在37.8-39.5 ℃且温差不超0.4 ℃的动物纳入实验^[10]，最终每组随机分配3只兔。实验前2 h及1 h测2次肛温，取平均值作为正常温度，将冻干组材料浸提液、化学组材料浸提液及生理盐水分别通过耳缘静脉缓缓推入体内 (10 mL/kg)，隔1 h测1次肛温，共测3次，每组均减去正常温度作为升高温度，每组升高温度之和小于1.4 ℃且每只不超0.6 ℃为合格。

皮内刺激实验：取6只新西兰白兔，背部被毛10 cm× 20 cm，划分为6区，脊柱两侧各3区，左侧近头部区3个点注射生理盐水各0.2 mL，左侧尾部3个点注射体积分数20%乙醇各0.2 mL，分别为阴性和阳性对照。右侧头部3点注射0.2 mL冻干组材料浸提液，尾部3点各注射0.2 mL化学组材料浸提液，注射完毕后在注射点用滴有生理盐水的纱布盖住，并在1，6，24，48，72 h观察注射点皮肤变化，按皮肤反应评分系统进行评分，计算局部原发刺激指数PⅡ和平均原发刺激指数APⅡ^[11]。

观察皮肤损伤情况及评分标准：①红斑和焦痂形成：无红斑，0分；极轻微红斑(勉强可见)，1分；红斑清晰，2分；中度红斑，3分；重度红斑(紫红色)至焦痂形成，4分。②水肿形成：无水肿，0分；极轻微水肿(勉强可见)，1分；水肿清晰(肿起，不超出区域边缘)，2分；中度水肿 (肿起约1 mm)，3分；重度水肿(肿起超过1 mm并超出接触区)，4分；刺激最高记分8分。

根据评分情况判断皮肤刺激反应类型：0-0.4分，极轻微；0.5-1.9分，轻度；2.0-4.9分，中度；5.0-8.0分，重度。

主要观察指标：羊脊椎松质骨支架材料动物急性毒性实验、热源实验、皮内刺激实验及细胞生物相容性检测结果。

统计学分析：将测得的各组数据运用SPSS 17.0统计软件进行分析，采用单因素方差分析进行组间比较，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

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讨论

随着近年来骨组织工程的快速发展，为组织工程支架材料选择提供了越来越多的方法，在最初阶段主要采用自体骨移植，自体骨最大优点就是没有免疫原性，能最大程度降低植入材料的排斥反应，但是在取骨过程中又间接给患者造成二次损害，当缺损面积较大时这一来源也不能满足手术需要。随着组织工程的迅速发展，通过人工替代材料构建与人体骨组织类似且免疫原性低的替代骨已成为热点，近年来出现的这些支架材料具有良好的生物相容性和骨传导能力，其降解速率与成骨速率相匹配，它们的出现可以有效替代自体骨来源不足这一问题，防止二次损害的发生，这种人工支架材料需要形态、结构和功能与人体骨组织及缺损相适应。骨组织工程包括支架材料、种子细胞和生长因子等，而支架材料作为这里面的框架，为生长因子及种子细胞生长提供空间，对植骨的成败起着关键作用。

由于骨组织中含有大量脂质、蛋白等物质，这些在异种骨作为支架材料植入体内过程中会引起不同程度的免疫反应。传统的化学处理等方法不能完全去除免疫原性，抗免疫原性有许多方法，如短期内采用免疫抑制剂及采取免疫隔离^[13-15]，但在应用到口腔颌面部时对美容要求很高，直接影响患者心理，所以在处理支架材料过程中要经过更加严格细致的方法，如低温冷冻、高温煅烧、射线照射^[16-18]，实验选用低温冷冻联合⁶⁰Co照射，通过细胞急性毒性实验、急性动物实验等深入测得冻干异种骨支架材料的生物性能。

支架材料需应用于人体中必须无毒，而且支架材料同时又必须达到一定的要求^[19-34]：生物相容性好，没有任何毒性，不会引起炎症，更不会引起畸形；有良好的力学性能，机械性能良好，在承受一般力量时不会造成塌陷及变形；降解性能良好，降解应与新骨生成速率相匹配；有良好的空间结构。

生物相容性测试主要针对应用于临床前试验阶段的测试，包括细胞相容性测试、体外动物实验及体内植入试验等，主要意义在于预测及评价这种材料的生物学性能，以保证在植入体内过程中的安全性。细胞相容性测试及体外实验通过材料浸提液进行，观察其对细胞增殖，动物生长及代谢的影响，体内实验则是通过体内植入支架材料，在一段时间内观察动物生长状态，植入体周围及各器官的病理变化。文章通过细胞毒性实验、急性动物毒性实验等来检测冻干骨支架材料的生物相容性，在处理材料过程中要严格按照实验程序，如再冲洗过程中使用超纯水，以防止水中杂质进入支架材料空隙中，浸提液的制作严格按照无菌操作，通过皮试、耳缘静脉注射检测实验动物对浸提液的反应，结果提示冻干组性能良好，皮试也属于轻度刺激，但化学组却有轻微的致热作用，可能也与处理过程有关，比如氯仿、甲醇浸泡时致使材料内部有残留，或浸泡式材料内部未能得到完全浸泡，而单一化学处理不能使问题进一步解决，造成有轻微毒性，与田家亮、周天键等^[35-36]在化学处理中单纯用甲醇/氯仿脱脂作用差，不能完全去除抗原结果相似。但是化学处理后经过4周低温冷冻可以导致细胞冻伤，降低免疫原性，而细胞内冰的形成及冰融过程中渗透压变化对细胞的影响是已知影响因素，进一步经过真空干燥使支架中细胞数量减少，细胞膜发生改变，造成抗原表达有所改变，对免疫系统的刺激减少，最后经过⁶⁰Co照射后进一步降低了免疫原性。

上述结果表明，单纯化学处理羊松质骨不能达到作者的要求，而化学处理配合低温冷冻、真空干燥及⁶⁰Co照射能达到要求，为其临床应用打下良好的基础。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程
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生物相容性测试主要针对应用于临床前试验阶段的测试，包括细胞相容性测试、体外动物实验及体内植入试验等，主要意义在于预测及评价这种材料的生物学性能，以保证在植入体内过程中的安全性。细胞相容性测试及体外实验通过材料浸提液进行，观察其对细胞增殖，动物生长及代谢的影响，体内实验则是通过体内植入支架材料，在一段时间内观察动物生长状态，植入体周围及各器官的病理变化。文章通过细胞毒性实验、急性动物毒性实验等来检测冻干骨支架材料的生物相容性，在处理材料过程中要严格按照实验程序，如再冲洗过程中使用超纯水，以防止水中杂质进入支架材料空隙中，浸提液的制作严格按照无菌操作，通过皮试、耳缘静脉注射检测实验动物对浸提液的反应，结果提示冻干组性能良好，皮试也属于轻度刺激，但化学组却有轻微的致热作用，可能也与处理过程有关，比如氯仿、甲醇浸泡时致使材料内部有残留，或浸泡式材料内部未能得到完全浸泡，而单一化学处理不能使问题进一步解决，造成有轻微毒性，与田家亮、周天键在化学处理中单纯用甲醇/氯仿脱脂作用差，不能完全去除抗原结果相似。但是化学处理后经过4周低温冷冻可以导致细胞冻伤，降低免疫原性，而细胞内冰的形成及冰融过程中渗透压变化对细胞的影响是已知影响因素，进一步经过真空干燥使支架中细胞数量减少，细胞膜发生改变，造成抗原表达有所改变，对免疫系统的刺激减少，最后经过⁶⁰Co照射后进一步降低了免疫原性。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

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冻干去抗原羊松质骨支架的生物相容性评价

Biocompatibility of freeze-dried antigen-extracted sheep cancellous bone scaffolds

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